Biólogo faz alerta e denuncia pesquisa com animais em Universidade Federal

Pesquisas envolvendo ensaios comportamentais, desenvolvimento cognitivo, memória espacial, testes eletrofisiológicos e morfologia de células nervosas conduzidos em diferentes espécies animais na Universidade Federal do Pará – UFPA

O presente artigo descreve algumas pesquisas conduzidas por grupos de trabalho formados por pesquisadores da Universidade Federal do Pará – UFPA. São projetos que foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa com Animais de Experimentação e escritos em sua maior parte na forma passada e não futura (o que nos leva a crer que muitos dos procedimentos já tenham sido realizados nos animais, o que seria uma não conformidade com o estabelecido em lei).

Comitês de ética ao uso de animais em experimentos, ao contrário de comitês de ética na pesquisa com seres humanos, trazem o viés de considerar animais como objetos passiveis de serem utilizados em pesquisa, desconsiderando seus interesses pessoais. Nunca é demais lembrar que esses mesmos procedimentos, se fossem propostos a serem conduzidos em seres humanos seriam classificados como tortura, crime ou outros termos ainda menos elegantes. De toda forma, seriam considerados ilegais.

Teste de Campo Aberto (esquerda), Ambliopia (direita)

Por que, então, podemos conduzir esses mesmos procedimentos em animais que consideramos “de experimentação”? Animais, ao contrário dos seres humanos, não podem entender os propósitos dos procedimentos, nem podem consentir ou recusar tomar parte nos procedimentos.

Comitês de ética para a pesquisa com animais, portanto, trazem a palavra “ética” deslocada de seu significado, pois mesmo a presença de alguns poucos membros interessados realmente em defender os interesses dos animais não configura algum beneficio aos animais, visto que tais pessoas não tem poder para impedir a continuidade dos procedimentos. São sempre minorias frente aos interessados na pesquisa, direta ou indiretamente. São voto vencido.

Descreverei a seguir algumas propostas de pesquisa que circulam pelo CEUA da Universidade Federal do Pará UFPA. Novamente, não posso informar quais desses procedimentos foram já conduzidos antes mesmo dos procedimentos haverem sido descritos ao comitê (os protocolos encontram-se na forma pretérita). Tampouco sei quais dessas pesquisas receberam o aval do Comitê.

Espero com essa denúncia influenciar, por meio da familiarização da opinião pública, para que esses procedimentos sejam recusados pelo Comitê, e para que a população entenda que aval de um Comitê de Ética ao Uso de Animais não significa, de forma alguma, um bem aos animais.

Não poderei sempre denunciar cada procedimento que venha a ser submetido para cada Comitê de Ética de cada universidade ou centro de pesquisa do Brasil, mas espero com esse pequeno exemplo fazer com que as pessoas entendam que Comitês de Ética em nada zelam pela ética.

Projeto 1:
“Alteração e reabilitação da atividade mastigatória, memória espacial e avaliação da população astrocitária em modelo murino em desenvolvimento e senil.”

Objetivo: verificar se a privação da mastigação em ratos influencia no número de seus astrócitos (células nervosas em forma de estrela) e avaliar se ratos que não podem mastigar tem sua memória espacial influenciada.

Vitimas: 384 fêmeas de camundongos

Procedimento: as camundongos-fêmeas, após desmamarem de suas mães, foram divididas em diferentes grupos, de acordo com o tempo de vida que elas deveriam viver, o tipo de alimento que receberiam e se seriam criadas em ambiente pobre ou enriquecido.

Dessa forma, um terço dos animais viveu 6 meses, um terço viveu 12 meses e um terço viveu 18 meses (janela temporal). Um quarto dos animais recebeu somente ração em pellet, um quarto recebeu ração em forma de farelo, um quarto recebeu pellet metade de sua vida e ração farelada a outra metade e um quarto recebeu as sequências de pellet, farelada e pellet novamente em tempos equivalentes entre si, e proporcionais à idade.

Após completarem a janela temporal, os animais foram submetidos aos testes comportamentais e depois mortos (ou no eufemismo acadêmico, “sacrificados”) com overdose de Avertina e tiveram seus crânios cortados. Foram feitas lâminas histológicas de pedaços de seus cérebros e os astrócitos presentes na região CA1 do hipocampo foram contados e comparados.

Crítica: Podemos facilmente entender que a pobreza ou o enriquecimento ambiental influenciam na memória e aprendizado espacial. Isso já está cansativamente demonstrado não apenas em animais experimentais, mas principalmente seres humanos (alguém duvida que o estímulo constante do cérebro mantém sua saúde por mais tempo?).

O que não dá para entender é de onde poderá se concluir que animais que mastigaram mais ou menos ao longo de suas vidas possuem maior capacidade de aprendizagem ou o que seja. Ainda que a pesquisa encontre alguma correlação estatística, jamais isso poderá provar que uma coisa cause a outra.

Como exemplo disso cito o site do estudante de Harvard Tyler Vigen que mostra várias correlações espúrias, como a que relaciona o aumento dos investimentos americanos em pesquisas na área de ciência e tecnologia e o aumento nas taxas de suicídio por enforcamento, estrangulamento e sufocação, ou as estatísticas que mostram que o número de afogamentos de pessoas que caíram em piscinas flutua de acordo com o número de vezes que o ator Nicolas Cage aparece na TV.

Não vejo como explicar cientificamente, ainda que se encontre uma correlação estatística, que a mastigação influencie no desenvolvimento mental de ratos, e que isso possa de alguma maneira ser aplicado aos seres humanos.

Projeto 2:
“Ensaios comportamentais e neuropatológicos na doença Príon com alteração e reabilitação da atividade mastigatória e enriquecimento ambiental em modelo murino senil.”

Objetivo: Essa pesquisa-irmã da anteriormente citada visou verificar as possíveis influências do ambiente, da idade e da redução da atividade mastigatória sobre o aprendizado e memória e comportamentos, acrescido do tratamento que pretende simular doenças neurodegenerativas em camundongos.

Vitimas: 348 camundongos-fêmeas com no máximo 15 meses de vida.

Procedimento: Da mesma forma que no projeto anterior, as camundongos-fêmeas, após desmamadas, foram divididas em grupos de acordo com o tempo de vida que elas deveriam viver (duas janelas temporais, de 9 e 15 meses), o tipo de alimento que receberiam (os mesmos tratamentos do projeto anteriormente descrito) e se seriam criadas em ambiente pobre ou enriquecido.

Os animais da janela temporal de 9 meses foram inoculados por via intra-cerebral aos 5 meses de idade com um homogeneizado cerebral contaminado pelo agente ME7 (para indução da doença príon, suposto modelo para doenças neurodegenerativas em seres humanos) e os animais da janela temporal de 15 meses foram inoculados aos 11 meses com o mesmo agente. Os animais do controle receberam homogeneizado cerebral normal (sem o agente ME7), para comparação.

Após completarem a janela temporal ou apresentarem a doença príon, os animais foram submetidos aos testes comportamentais e depois foram mortos e os procedimentos realizados no projeto acima descrito foram conduzidos também nesse caso, para comparar os astrócitos do hipocampo e as micróglias do giro denteado nos diferentes tratamentos (ou seja, a intenção é verificar se há diferença no desenvolvimento de estruturas cerebrais e diferenças comportamentais para cada um dos tratamentos).

Crítica: Novamente o questionamento quanto ao projeto anterior caberia a esse projeto, pois não parece haver justificativa científica para se relacionar mastigação e desenvolvimento de células nervosas.
No mais, já é conhecida a correlação entre desenvolvimento cerebral e estímulos ambientais e a correlação entre doenças neurodegenerativas e menor desenvolvimento cognitivo, não apenas em animais, mas também no ser humano.

Acrescento a essa proposta uma outra critica: A doença príon, ocasionada pela inoculação de agente ME7 em ratos e camundongos, pretende simular doenças neurodegenerativas em seres humanos, no entanto, esse modelo não condiz com a doença tal como ocorre em nossa espécie. Tal inoculação tão somente cria uma situação em que os animais manifestam sintomas semelhantes aos sintomas manifestados por seres humanos padecendo de uma doença neurodegenerativa (numa comparação burlesca, mas não falsa, seria como se considerássemos modelo válido para a gripe soprar rapé seco nas narinas da cobaia).

Projeto 3:
“Alterações comportamentais e neuropatológicas induzidas pela infecção por arbovírus Piry no camundongo senil albino suíço: impacto do ambiente enriquecido”.

Objetivo: verificar os prejuízos comportamentais aos camundongos da infecção pelo virus Piry, bem como em que extensão o enriquecimento ambiental auxilia na neuroproteção.

Vitimas: 80 camundongos fêmeas

Procedimento: Camundongos de 2 meses foram separados em dois grandes grupos, um que permaneceu em um Ambiente Enriquecido e outro que permaneceu em Ambiente Pobre (Padrão). Os animais foram mantidos nessas colônias até completarem de 16 a 18 meses.

Assim que atingiram essa idade os camundongos passaram a ser considerados idosos, então eles começaram a ser submetidos a três testes de comportamentos diferentes, o Burrowing (um teste relacionado á remoção e estocagem de alimentos e que segundo o projeto é bastante sensível à instalação de infecções), o de Campo Aberto (que cria grande ansiedade nos animais) e o de Discriminação Olfatória (que verifica os prejuízos causados pelo vírus à memória olfatória dos animais).

Assim que realizaram todos os testes, esses animais foram inoculados, por via intranasal (A neuroinvasão pelo vírus Piry se dá pela via olfatória.), com homogeneizado cerebral infectado pelo vírus Piry, sendo 4 os grupos de estudo: 1. Animais criados em Ambiente Enriquecido e que receberam o vírus Piry; 2. Animais criados em Ambiente Enriquecido e que receberam homogeneizado cerebral sem o vírus (controle); 3. Animais criados em Ambiente Pobre e que receberam o vírus Piry; 4. Animais criados em Ambiente Pobre e que receberam homogeneizado cerebral sem o vírus (controle).

Posterior a essa infecção os animais foram monitorados para verificar o início dos sintomas clínicos ocasionados pelo vírus. Subgrupos dentro de cada grupo foram submetidos periodicamente aos mesmos três testes comportamentais que haviam sido submetidos anteriormente para verificar alterações em seu comportamento ocasionados pela infecção viral. Os animais submetidos a esses testes foram mortos e seus cérebros foram processados para análise neuropatológica.

Críticas: O vírus Piry, em camundongos, causa encefalomielite, miocardite, alterações do tecido conjuntivo e hiperplasia retículo-histiocitária em rins, fígado e baço. Mais da metade dos camundongos morrem nos primeiros dias após inoculação intracerebral ou intraperitoneal. Trata-se, portanto, de um vírus extremamente mortal para camundongos.

Em seres humanos esse mesmo vírus praticamente não incide. Embora em algumas regiões uma grande percentagem da população apresente anticorpos neutralizantes para o mesmo (o que significa que tiveram contato com ele), há apenas 6 casos reportados de infecção humana, sempre relacionados a acidentes no ambiente de laboratório e com quadro clínico completamente distinto do apresentado pelos camundongos. Não se trata, portanto, de vírus de importância médica.

Se não tem importância médica caem por terra declarações na linha de que o “sacrifício” desses animais de alguma forma salvará vidas humanas, recaindo essa pesquisa na categoria dos projetos acadêmicos que visam bolsas de agência de fomento e conferir títulos a estudantes de pós graduação.
Trata-se, aliás, de repetição de resultados já conhecidos, já que a literatura já mostra os efeitos que vírus Piry tem sobre o comportamento de camundongos e o papel protetivo do enriquecimento ambiental (ex. http://www.iec.pa.gov.br/newiec/pibic/pt/files/res2007-06.pdf; http://repositorio.ufpa.br/jspui/bitstream/2011/3204/6/Dissertacao_EstudoAlteracoesNeuropatologicas.pdf, etc), inclusive com a participação do próprio pesquisador que propôs o projeto.

Projeto 4
“Alterações Comportamentais, Histopatológicas e da Morfologia Microglial Induzidas por Inoculação Sequencial de VDEN1 e VDEN4 em Modelo Murino.”

Objetivo: estabelecer um modelo animal de infecção secundária e sequencial por dois diferente sorotipos do vírus da dengue (sorotipos 1 e 4), avaliar a progressão da doença, descrever as alterações comportamentais e histopatológicas em fígado e pulmão induzidas pela infecção sequencial pelos 2 sorotipos e avaliar as mudanças da morfologia da micróglia (células nervosas).

Vitimas: 72 camundongos fêmeas

Procedimentos: Camundongos foram divididos em dois grupos. Um grupo foi inoculado por via intraperitoneal com homogeneizado cerebral infectado com vírus da dengue sorotipo 1 e após 28 dias foi infectado com homogeneizado cerebral com vírus da dengue sorotipo 4. Outro grupo recebeu homogeneizado cerebral não infectante e após 28 dias o mesmo tratamento.

Para intensificar as alterações clínicas ou comportamentais semelhante às obtidas sob o regime de múltiplas infecções, os animais foram inoculados na fase final do experimento com homogeneizado cerebral infectado com o sorotipo 1 ou sorotipo 4 em dias alternados, e após 24 horas inoculados com soro anti-sorotipo 2, durante 7 dias. Durante a fase de experimentação os animais foram submetidos a testes comportamentais (Burrowing e Campo Aberto). Ao término de todo o período de testes e inoculações os animais foram sacrificados e suas vísceras e os encéfalos foram analisadas histologicamente.

Crítica: é triste que em pleno século XXI ainda existam pesquisas cujo objetivo principal seja consolidar um modelo animal que pretenda mimetizar os efeitos de uma infecção natural do ser humano mediante uma infecção artificial de uma cobaia.

Ainda que as alterações provocadas pelo vírus no camundongo de alguma forma lembrem as alterações provocadas em seres humanos há uma série de outras variáveis que fazem com que o modelo seja pobre e pouco representativo da doença natural.

Há muitas pessoas que naturalmente já se encontram infectadas pelos sorotipos 1 e 4 da dengue, de modo que as alterações histológicas em seres humanos já são ou podem vir a ser conhecidas, sem a necessidade do uso de camundongos.

Projeto 5
“Investigação de efeitos lesivos na mucosa gástrica e lesão hepática de doses terapêuticas de salicitamol frente ao acido acetilsalicilico e paracetamol”

Objetivo: O objetivo do projeto é investigar o potencial toxicológico do “Salicitamol” (uma associação molecular entre o Ácido Acetilsalicílico e o Paracetamol) em bioensaios com larvas de Artemia salina (pequenos crustáceos aquáticos) e verificar, comparativamente, seu potencial ulcerogênico em ratos em relação ao acido acetilsalicílico, e seu potencial hepatotóxico em ratos em relação aos efeitos causados pelo paracetamol.

Vitimas: 40 ratos fêmeas e 40 ratos machos de 90 dias de idade e 100 artêmias salinas (pequenos crustáceos aquáticos).

Procedimentos: No bioensaio de toxicidade para as larvas de Artemia salina, elas foram expostas a concentrações diferentes de solução de salicitamol (1000 ppm, 500 ppm e 100 ppm) em tubos de ensaios. Apos 24 horas em contato com a solução foi feita a contagem do numero de larvas vivas em relação ao número de larvas mortas. Esse ensaio visa estabelecer qual concentração de solução mata que quantidade de crustáceos.

Na avaliação da toxicidade aguda do salicitamol e comparação ao efeito do ácido acetilsalicílico foram utilizados 10 ratos em jejum de 24 horas, que receberam 5 mg/kg de salicitamol e após 4 horas foram mortos. Seus estômagos foram retirados, abertos e sua mucosa foi inspecionada e comparada a um grupo de ratos que recebeu ácido acetilsalicílico e um grupo controle que recebeu apenas o veículo. O mesmo estudo foi repetido comparando os efeitos do salicitamol e do paracetamol para o fígado e rins dos ratos.

Na avaliação da toxicidade subcrônica ratos machos e fêmeas foram divididos em 2 grupos, sendo que um deles recebeu uma dose diária de 5 mg/Kg e o outro não (controle), por 28 dias. Durante o período experimental, todos os animais foram observados para a verificação de algum sinal de toxicidade (como capacidade exploratória). A cada sete dias amostras de sangue foram tiradas da cauda dos animais para verificar a glicemia. Apos o período experimental, os animais foram decapitados com uma guilhotina, seu sangue foi aproveitado para exames hematológicos e bioquimicos.

Além desses estudos também foram realizados testes eletrofisiológicos, onde os ratos tiveram eletrodos implantados no cérebro, com uma incisão cirúrgica de 3 cm, que expôs a superfície óssea do crânio e, após, foram feitas duas perfurações com aparelho odontológico para fixação dos mesmos. Após 24 horas alguns animais receberam salicitamol e outros receberam apenas o veículo (grupo controle), sendo o perfil eletrofisiológico dos animais acompanhados e comparados nos dias seguintes, por mais 28 dias de experimento. Após esse período os animais foram mortos.

Crítica: Ácido acetilsalicílico e Paracetamol são anti-inflamatórios que apresentam efeitos antipiréticos e analgésicos. Por serem também utilizados para o tratamento de doenças crônicas (artrite reumatoide, osteoartrite, doença renal crônica, doenças reumáticas, etc), que em geral acometem idosos, há uma preocupação em relação aos efeitos de seu uso prolongado, em especial em relação à sua toxidade gástrica e hepática.

Embora essas drogas também provoquem ulcerações e problemas renais e hepáticos em ratos não há uma equação que permita extrapolar que doses sendo prejudiciais ou letais para ratos (ou Artemias salinas) seriam seguras para o ser humano. Não há uma linearidade que permita extrapolar os dados apenas com base em volume ou peso corpóreo. Animais diferentes podem apresentar especial sensibilidade a substâncias diferentes.

Além disso, para verificar simplesmente o potencial ulcerogênico e hepatotóxico de substâncias há vários modelos in vitro que permitem acessar essa mesma informação sem matar animais, a um custo mais baixo e com resultados em menos tempo. Não há justificativa para que se façam pesquisas com animais, ainda mais se existem métodos substitutivos que permitem obter a mesma informação sem o uso prejudicial de animais.

Projeto 6
“A resposta inflamatória microglial na ambliopia: estudo experimental em gatos.”

Objetivo: Analisar a resposta inflamatória no córtex visual primário e em áreas associativas que exibem função binocular, após indução da ambliopia experimental (indução de deficiência no desenvolvimento normal do sistema visual durante o período de maturação do sistema nervoso central) e verificar o papel do ambiente enriquecido sobre a acuidade visual binocular em gatos e o curso temporal de sua ambliopia mediante testes comportamentais.

Verificar alterações neuropatológicas e morfológicas no sistema nervoso de animais (células gliais e neuronais) criados em ambiente pobre e enriquecido, com e sem ambliopia experimental, com vistas a correlacionar às performances visuomotoras dependentes de interação binocular, assim como o seu possível impacto sobre funções cognitivas que requerem tais interações.

Vitimas: 24 gatos de ambos os gêneros

Procedimentos: Gatos com idade de 23 dias foram induzidos à ambliopia mediante administração forçada de sulfato de atropina a 1% no olho esquerdo (um grupo controle não sofreu o procedimento).
Quando completaram 60 dias os gatos foram divididos em dois subgrupos: animais criados em ambiente enriquecido e criados em ambiente padrão.

Aos 90 dias metade dos animais de cada subgrupo foi submetida a um teste comportamental de acuidade visual que induz uma escolha entre duas opções possíveis, obrigando o gato a detecção visual de uma grade composta por barras escuras e claras de frequência espacial conhecida. As pistas visuais (grades) vão diminuindo com a espessura da barra à medida que o animal alcança o índice de acerto nas escolhas de 70% das tentativas em cada série.

Ao fim dos testes comportamentais, todos os gatos foram pesados e mortos com overdose de cetamina e xilazina. Em seguida foram perfundidos por via transcadiarca com solução salina heparinizada, seguido de paraformaldeido e foram analizados bioquímica e histologicamente.

Os demais gatos no qual supostamente se induziu a ambliopia foram submetidos a uma readaptação do olho privado e submetido novamente aos testes comportamentais para verificar se a acuidade visual melhorou após três meses.

Por fim todos os gatos foram mortos para que se pudesse comparar a morfometria das células gliais e neuronais do grupo submetido à ambliopia e os que não foram submetidos (controle), bem como dos animais criados em ambiente pobre e criados em ambiente enriquecido.

Criticas: A ambliopia se caracteriza pela perda de visão causada por processos naturais ocorridos durante o processo de maturação do SNC, que não implicam em qualquer anomalia estrutural ao olho. Dessa forma, o procedimento adotado para induzir ambliopia em modelos animais, que seja costurando a pálpebra de um de seus olhos ou, como no caso do projeto, pingando sulfato de atropina no olho dos gatos, embora efetivamente cause prejuízos à visão dos gatos, não é representativo do que é ambliopia.

A escolha de gatos (ao invés de roedores) para o referido experimento se deu pelo fato destes animais apresentarem visão binocular (sendo uma das principais consequências da ambliopia o prejuízo na binocularidade e na percepção de profundidade), no entanto, a visão dos gatos é bastante distinta da visão humana.

Gatos possuem um campo visual e visão periférica muito maior, cerca de sete vezes mais bastonetes e cerca de 10 vezes menos cones que os seres humanos. Além disso, sua acuidade visual durante o dia é inferior à nossa devido a uma camada de células na retina que são muito sensíveis à luz e os ofuscam (se chama Tapetum Lucidum).

Resulta que eles têm melhor percepção de movimentos rápidos do que humanos, mas possuem menor acuidade para objetos estáticos, cores, texturas e para a visão à distância.
Os testes comportamentais em gatos provavelmente estarão enviesados porque não é possível se determinar se os gatos em que supostamente se induziu a ambliopia manifestam dificuldade de visualizar em profundidade.

Além disso, faz-se necessário verificar se a UFPA possui um biotério para criar e manter gatos, o que caso contrário tornaria a proposta do projeto ilegal de acordo com o próprio artigo 14 da Lei Arouca, que exige em seu texto que o animal só poderá ser submetido às intervenções que constituem a pesquisa quando, antes, durante e após o experimento, receber cuidados especiais, o que demanda um biotério.

Projeto 7
“Memória espacial e morfometria tridimensional da micróglia de CA1 e do giro denteado do Cebus apela”.

Objetivos: correlacionar a morfologia de estruturas cerebrais (micróglia do hipocampo e giro denteado) e o desempenho cognitivo (aprendizado e memória espacial) de macacos prego.

Vitimas: 4 macacos-prego

Procedimentos: Detalhes dos procedimentos conduzidos nos animais não foram especificados no material submetido ao Comitê de Ética, mas pelo que se pode entender os macacos foram obrigados a desempenhar tarefas cognitivas hipocampo-dependentes, utilizando-se testes selecionados da Bateria Cambridge de Testes Neuropsicológicos (CANTAB).

Foram também utilizados testes motores de adaptação a tela para checar a adaptação dos indivíduos à tela sensível ao toque e o teste de aprendizado pareado (TAP) para avaliar aprendizado e memória espacial.

Para o estudo da correlação entre o desempenho individual no TAP da bateria CANTAB e a morfologia da micróglia, foi necessário reconstruir e analisar parâmetros morfométricos selecionados a partir de micróglias reconstruídas empregando microscopia tridimensional.

De que forma os animais foram manejados e posteriormente mortos foram omitidos no protocolo.

Criticas: O protocolo submetido informa que os animais foram fornecidos para a pesquisa pelo IBAMA. É uma vergonha que o órgão ambiental responsável por receber animais por entrega voluntária, resgate ou oriundos de apreensões de fiscalização, os tenha submetido à pesquisa biológica, algum laboratório que os irá torturar e por fim matar, ao invés de destiná-los para a reabilitação, soltura ou encaminhá-los para criadores conservacionistas.

As demais críticas quanto ao modelo animal também se aplicam aqui, pois tais alterações morfológicas poderiam ser observadas diretamente a partir da dissecação de seres humanos.